修飾的凹凸棒固定化醇脫氫酶及其在手性合成中的應(yīng)用
來源：中國凹凸棒土網(wǎng) 02-11 11:47
生物催化是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的酶催化合成各種新的化合物和天然產(chǎn)物的過程。由于生物催化反應(yīng)簡單易行和高效的特點(diǎn)，近來十多年，生物催化劑在有機(jī)合成中應(yīng)用的數(shù)量快速的增加，特別是對于手性化合物的合成。在它們中間，醇脫氫酶（alcohol dehydrogenases，ADH，EC1.1.1.1）成為了焦點(diǎn)，它是一種氧化還原酶，在催化反應(yīng)中具有很高的立體和區(qū)域選擇性，能催化還原一系列潛手性的酮酯轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的手性醇，而后者是合成藥物，農(nóng)用化學(xué)品，芳香劑的重要手性砌塊。 在生物催化反應(yīng)中，使用游離的酶作生物催化劑，反應(yīng)活性很高，但是反應(yīng)產(chǎn)物提取和分離的過程復(fù)雜。而通過固定化后，酶的穩(wěn)定性提高，產(chǎn)物易于分離，并且還可以反復(fù)使用，降低了生產(chǎn)成本。因此，近年來在生物技術(shù)中固定化成為了研究熱點(diǎn)。 固定化酶的方法很多，常用的有吸附法，共價(jià)結(jié)合法，包埋法；所用的材料包括了合成的有機(jī)聚合物，生物高分子聚合物，無機(jī)材料等。為了克服有機(jī)材料機(jī)械強(qiáng)度低，穩(wěn)定性差的不足，本文在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，從透性化啤酒酵母細(xì)胞中提取醇脫氫酶，采用共價(jià)結(jié)合法，以衍生化的無機(jī)材料凹凸棒作為載體，固定化醇脫氫酶。 選擇凹凸棒（attapulgite，ATP）作為載體，利用了凹凸棒具有抗酸性，熱力學(xué)穩(wěn)定性和較高的機(jī)械強(qiáng)度的性能，來達(dá)到提高酶的pH，熱力學(xué)，操作和反復(fù)使用的穩(wěn)定性的目的。本文選擇了乙酰乙酸乙酯作為模型底物，用固定化醇脫氫酶作為生物催化劑，催化不對稱還原乙酰乙酸乙酯（ethyl acetoacetate，EOB）為S型的3-羥基-丁酸乙酯（ethyl（S）-3-hydroxy butyrate，（S）-EOB）；主要對透性化啤酒酵母提取醇脫氫酶的影響因素，固定化醇脫氫酶以及催化不對稱合成S型3-羥基-丁酸乙酯的條件進(jìn)行了研究；并且以游離和固定化醇脫氫酶的活性，不對稱還原反應(yīng)的產(chǎn)物的產(chǎn)率、對應(yīng)體過量值ee（enantiomeric excess）為指標(biāo)，考察了分離提取的醇脫氫酶和固定化醇脫氫酶的穩(wěn)定性，及其他因素對催化合成的影響。對透性化啤酒酵母中提取ADH的影響因素及提取的ADH穩(wěn)定性進(jìn)行了研究 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離提取醇脫氫酶的過程中，細(xì)胞量與緩沖液的比（W：v）5：20，在5℃，pH7.5磷酸緩沖液中超聲破碎細(xì)胞，加入的硫酸銨為35％，所提取的ADH酶的活性最高達(dá)到105U/ml。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，ADH粗提液的最適pH和溫度分別為7.0，25℃。通過紅外檢測，用氨基硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）對凹凸棒進(jìn)行衍生化處理，得到了硅烷衍生化的凹凸棒。 而制備固定化ADH中，最佳條件為：戊二醛的濃度0.5％，固定化溫度30℃，pH6.8。最后得到的固定化ADH酶的活性最高可以達(dá)到0.074U/mg。固定化ADH的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，與游離的ADH相比，固定化后ADH穩(wěn)定性有明顯提高，它的最適溫度與pH值分別為35℃，pH7.5；在水浴中震搖32h，仍熱保持原有活性的58％。 催化不對稱合成實(shí)驗(yàn)表明，在0.1M pH7.0的磷酸緩沖液中，反應(yīng)2個(gè)小時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)率可以達(dá)到88％，（S）-EHB的ee達(dá)到99.2％，固定化的ADH，經(jīng)8次循環(huán)使用后，活性仍保留42％。
關(guān)鍵詞：
醇脫氫酶 分離提取 凹凸棒載體 手性合成 生物催化劑 固定化ADH
作者：
趙泉
學(xué)位授予單位：
重慶醫(yī)科大學(xué)
授予學(xué)位：
碩士
學(xué)科專業(yè)：
生物制藥與生物醫(yī)用材料
導(dǎo)師姓名：
于明安
學(xué)位年度：
2009
語種：
中文
分類號(hào)：
Q554.9
在線出版日期：
2009年12月25日
關(guān)鍵詞：
醇脫氫酶 分離提取 凹凸棒載體 手性合成 生物催化劑 固定化ADH
作者：
趙泉
學(xué)位授予單位：
重慶醫(yī)科大學(xué)
授予學(xué)位：
碩士
學(xué)科專業(yè)：
生物制藥與生物醫(yī)用材料
導(dǎo)師姓名：
于明安
學(xué)位年度：
2009
語種：
中文
分類號(hào)：
Q554.9
在線出版日期：
2009年12月25日
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